전반사 형광 현미경(Total Internal Reflection Fluorescence microscopy, TIRF)은 광학 현미경의 한 종류로, 시료의 표면 근처에서 발생하는 형광만을 선택적으로 관찰하기 위해 고안된 기술이다. 이 방식은 빛이 굴절률이 높은 매질에서 낮은 매질로 진행할 때 특정 각도 이상에서 발생하는 전반사 현상을 이용한다. 일반적인 형광 현미경이 시료 전체를 여기(excitation)시키는 것과 달리, TIRF는 표면으로부터 수백 나노미터 이내의 영역만을 국소적으로 조명한다는 점이 특징이다.

TIRF의 물리적 원리는 전반사 시 발생하는 소멸파(Evanescent wave)에 근거한다. 입사광이 유리 슬라이드와 시료 사이의 경계면에서 전반사될 때, 빛의 에너지는 경계면을 넘어 시료 쪽으로 아주 짧은 거리만큼 침투한다. 이 소멸파의 강도는 표면에서 멀어질수록 지수함수적으로 급격히 감소하기 때문에, 표면에서 약 100~200nm 이내의 좁은 구역에 있는 형광 분자들만이 선택적으로 활성화된다. 이러한 원리 덕분에 초점에서 벗어난 배경 형광을 효과적으로 차단할 수 있다.

이 기술의 가장 큰 장점은 매우 높은 신호 대 잡음비(Signal-to-Noise Ratio)를 제공한다는 것이다. 일반적인 낙사 형광 현미경이나 공초점 현미경은 초점 평면 이외의 영역에서 발생하는 불필요한 배경광으로 인해 미세한 신호를 포착하는 데 한계가 있다. 반면 TIRF는 배경 잡음을 획기적으로 낮추어 단일 분자 수준의 관찰을 가능하게 한다. 따라서 생체 분자 하나하나의 움직임이나 상호작용을 실시간으로 추적하는 연구에서 핵심적인 역할을 수행한다.

생물학적 응용 측면에서 TIRF는 주로 세포막 근처에서 일어나는 역동적인 현상을 연구하는 데 필수적이다. 세포의 세포외유출(Exocytosis)과 세포내섭취(Endocytosis), 소낭(Vesicle)의 이동 및 융합, 그리고 세포 표면 수용체와 리간드의 결합 과정 등이 대표적인 관찰 대상이다. 또한 세포 접착 단백질의 분포나 세포 골격의 변화를 나노미터 단위의 해상도로 분석하는 데에도 널리 사용된다.

다만 TIRF는 관찰 범위가 표면 근처로 극히 제한된다는 물리적 한계를 지닌다. 세포 내부 깊숙한 곳에서 발생하는 현상을 관찰하기에는 적합하지 않으며, 전반사 조건을 충족하기 위해 매우 높은 개구수(Numerical Aperture)를 가진 특수 대물렌즈가 요구된다. 이러한 제약에도 불구하고, TIRF는 초고해상도 현미경 기술(STORM, PALM 등)의 기초가 되는 등 현대 생물물리학 및 분자생물학 연구에서 대체 불가능한 도구로 자리 잡고 있다.